Sviluppo di un RT colorimetrico ottimizzato

May 17, 2023

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 21424 (2022) Citare questo articolo

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La pandemia di coronavirus ha accentuato la necessità di test diagnostici molecolari. Una tecnica molto utilizzata a questo scopo è la reazione a catena della polimerasi (PCR), una tecnica sensibile e specifica comunemente utilizzata come gold standard per la diagnostica molecolare. Tuttavia, richiede personale altamente qualificato e attrezzature che richiedono una manutenzione elevata e richiede relativamente tempo. Un'alternativa è la tecnica di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP), che non richiede la purificazione del campione o apparecchiature costose ed è simile alla PCR se confrontata in sensibilità e specificità. In questo articolo, abbiamo sviluppato un test point-of-care colorimetrico ottimizzato con amplificazione isotermica mediata da loop della trascrittasi inversa (RT-LAMP) utilizzando un dispositivo portatile per diagnosticare COVID-19. Sono state testate variabili come la concentrazione di primer, solfato di magnesio, betaina, guanidina cloridrato, Bst e la temperatura delle reazioni. Abbiamo anche creato un sistema di controllo qualità del pipettaggio, utilizzando una combinazione di coloranti, per evitare falsi negativi dovuti alla mancanza di campioni aggiunti alla provetta di reazione. L'olio minerale è stato incorporato nella composizione delle reazioni RT-LAMP per evitare l'evaporazione quando non è disponibile un coperchio riscaldante. Il test finale RT-LAMP è dieci volte più sensibile rispetto alla miscela master colorimetrica WarmStart di New England Biolabs con una sensibilità di 5 copie per μL.

Nel dicembre 2019, il mondo è stato testimone dell’esito di un nuovo coronavirus, denominato Sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2, o SARS-CoV-2. Il primo caso di infezione da SARS-CoV-2 è stato segnalato a Wuhan, in Cina, e presto si è diffuso in tutto il mondo, venendo notificato come nuova pandemia nel marzo 20201. Lo scoppio della pandemia ha rivelato la necessità globale di biologia molecolare test per identificare, isolare e curare le persone infette come mezzo per controllare la diffusione della malattia.

La reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR)2 è comunemente nota come la tecnica gold standard per i test molecolari dei virus a RNA, come SARS-CoV-2. La RT-PCR è una tecnica con elevata sensibilità e specificità, ma richiede apparecchiature costose e ad alta manutenzione, fasi estese di purificazione del campione e personale altamente qualificato. Con il rapido aumento delle persone infette, è diventata evidente la mancanza di reagenti, input, personale e attrezzature per i test molecolari e il mondo ha sperimentato una carenza di risorse di laboratorio per soddisfare la domanda.

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è stata descritta per la prima volta da Notomi e dai suoi colleghi nel 20003 come una tecnica di amplificazione dell'acido nucleico con elevata specificità ed efficienza, in grado di essere eseguita in condizioni isotermiche. Utilizza una DNA polimerasi a spostamento di filamento (privata dell'attività di esonucleasi 5 ′ → 3 ′) e un set di due o tre paia di primer progettati per creare anelli nel DNA a filamento singolo sintetizzato. Ogni volta che la polimerasi inizia una nuova amplificazione, rilascia il filamento di DNA precedentemente accoppiato, che forma una struttura ad anello che contiene nuovi siti di legame per la polimerasi, creando così un'amplificazione autopropagante. I prodotti finali della reazione sono strutture simili a cavolfiori con anelli multipli formati dalla ricottura tra ripetizioni alternativamente invertite del bersaglio3. Così come nella PCR, le reazioni LAMP possono anche essere accoppiate con un enzima trascrittasi inversa per eseguire l'amplificazione delle molecole di RNA.

L'alto grado di sintesi del DNA che si verifica nelle reazioni LAMP consente il rilevamento visivo di una reazione positiva. Ogni volta che la DNA polimerasi incorpora un dNTP nel filamento di DNA appena sintetizzato, rilascia un pirofosfato e una molecola protonica come sottoprodotto. Il pirofosfato, in presenza di ioni Mg2+, precipita come pirofosfato di magnesio modificando la torbidità della reazione. Il protone rilasciato diminuisce il pH della reazione, che può essere rilevato utilizzando un colorante colorimetrico sensibile al pH come il rosso fenolo e il blu di bromotimolo4,5.